色素結合法を用いたコラーゲンの定量

利用する消耗品・機器

・1.5mlチューブ

・50ml遠沈管

・96wellプレート

・遠心分離機

・マイクロプレートリーダー

・ローテーター（共同実験室にはまだない）

・サンプル：培地を測定する場合、FBS 含有量は 5 %以内のものとすること

利用する試薬

・Direct Red 80

・ピクリン酸飽和溶液

・コラーゲン from bovine achilles tendon（スタンダード用）

・0.5M酢酸（作成して試薬瓶に保管）

・0.5M水酸化ナトリウム水溶液（作成して試薬瓶に保管）

計測Range： 0,5,25,50,75,100μg

100μg以上は再度予備実験必要となる

測定方法

1). 染色液の準備として、Direct Red 80水溶液（1mg/ml）とピクリン酸飽和水を1：1で混合

2). スタンダード作成のために1.5mlチューブに0.5M酢酸に溶解したⅠ型コラーゲンを段階希釈（0,5,25,50,75,100μg）として100μl加え、更に染色液1mlを加える

※現在、冷凍で保存しているコラーゲン溶液は1000μg /㎖である

※可溶性のコラーゲンを購入：Collagen from rat tail：0.1 M acetic acid: 1 mg/mL (Allow to stir at room temperature 1-3 hours until dissolved.)

※冷凍保存でどれくらいデータが変化するかは今後検討が必要

3). 1.5mlチューブを転倒混和し、ローテーターで30分攪拌する

※1.5mlチューブがローテーターに合致しないため、サランラップなどで止めながら対応

4). 12000rpmで3分間遠心分離

5). 上澄み液を除去する

図にように赤い結晶のような

ものが確認できる。

※上澄み液を完全に取り除く

　　　　　　　　　　　　側面の黄色のピクリン酸を除去すること

6). 1mlの0.5M水酸化ナトリウム水溶液を加え、ボルテックス

7). 96Wellプレートに200μlずつ分注し、550nmで吸光度を測定する

※ 562nmで吸光度を測定する

8). 測定値をブランク値で補正し、検量線から得られる近似曲線式に代入し、コラーゲン量を測定する