健児 村田
色素結合法を用いたコラーゲンの定量
利用する消耗品・機器
・1.5mlチューブ
・50ml遠沈管
・96wellプレート
・遠心分離機
・マイクロプレートリーダー
・ローテーター(共同実験室にはまだない)
・サンプル:培地を測定する場合、FBS 含有量は 5 %以内のものとすること
利用する試薬
・Direct Red 80
・ピクリン酸飽和溶液
・コラーゲン from bovine achilles tendon(スタンダード用)
・0.5M酢酸(作成して試薬瓶に保管)
・0.5M水酸化ナトリウム水溶液(作成して試薬瓶に保管)
計測Range: 0,5,25,50,75,100μg
100μg以上は再度予備実験必要となる

測定方法
1). 染色液の準備として、Direct Red 80水溶液(1mg/ml)とピクリン酸飽和水を1:1で混合
2). スタンダード作成のために1.5mlチューブに0.5M酢酸に溶解したⅠ型コラーゲンを段階希釈(0,5,25,50,75,100μg)として100μl加え、更に染色液1mlを加える
※現在、冷凍で保存しているコラーゲン溶液は1000μg /㎖である
※可溶性のコラーゲンを購入:Collagen from rat tail:0.1 M acetic acid: 1 mg/mL (Allow to stir at room temperature 1-3 hours until dissolved.)
※冷凍保存でどれくらいデータが変化するかは今後検討が必要
3). 1.5mlチューブを転倒混和し、ローテーターで30分攪拌する
※1.5mlチューブがローテーターに合致しないため、サランラップなどで止めながら対応
4). 12000rpmで3分間遠心分離
5). 上澄み液を除去する
図にように赤い結晶のような
ものが確認できる。
※上澄み液を完全に取り除く

側面の黄色のピクリン酸を除去すること
6). 1mlの0.5M水酸化ナトリウム水溶液を加え、ボルテックス

7). 96Wellプレートに200μlずつ分注し、550nmで吸光度を測定する
※ 562nmで吸光度を測定する
8). 測定値をブランク値で補正し、検量線から得られる近似曲線式に代入し、コラーゲン量を測定する
